Hinter seinem blassen aber gepflegten Äußeren verbirgt sich eine unerwartete Härte, die er als FBI-Agent Cooper in der TV-Serie "Twin Peaks" und dem daraus resultierenden Prequel und Kinofilm effektvoll einsetzte. Mit David Lynch, dem Schöpfer der Kultserie, begann 1983 die Karriere von Kyle MacLachlan, als er in der Verfilmung des Science-Fiction-Romans "Der Wüstenplanet" den Erben des Reiches der Atreiden auf dem Planeten Arrakis spielte. Mit Lynchs "Blue Velvet", in dem er in einer Provinzstadt in den Bann einer Sängerin und eines Psychopathen gerät, wurde MacLachlan international bekannt und pflegt seitdem das Image des mit Unschuldsmiene agierenden, oft verschlagenen Saubermannes in Horrorfilmen ("The Hidden") und Krimis. Er spielte Band-Mitglied Ray Manzarek in Oliver Stones "The Doors" und den betrogenen Ehemann von Nastassja Kinski in Mike Figgis' "One Night Stand". In David Jones' Franz-Kafka-Verfilmung "Der Prozeß" übernahm er die Rolle des Prokuristen Josef K., eine Herausforderung, weil er unweigerlich mit Anthony Perkins in Orson Welles' gleichnamigen Film verglichen wurde.

MacLachlan, der häufig für das Fernsehen arbeitet und moderiert, ist auch auf der Bühne tätig.